在药品的微生物污染控制体系中,**是极其重要的一个组成部分。**工艺的选择、开发、验证、监控等整个生命周期中,离不开生物指示剂的使用,只有物理杀灭和生物杀灭效果均达到预定的标准,**工艺方可用于产品或组件的**。关于生物指示剂的使用,行业内一直存在诸多疑问,本文分两部分对生物指示剂进行详细的介绍,**部分重点介绍理论基础,包括**动力学(F0值、D值等概念和计算)、**法的选择和监控、物理杀灭和生物杀灭的一致性和验证等内容;**部分重点介绍生物指示剂的种类、包装形式、选择、使用和质量控制等内容。
生物指示剂(Biological Indicators),根据ISO11138的定义 - test system containing viable microorganisms providing a defined resistance to a specified sterilization process,即含有活的微生物的测试系统,其为特定的**工艺提供确定的抵抗力。2015年版《中国药典》四部1421**法的定义为“生物指示剂系一类特殊的活微生物制品,可用于确认**设备的性能、**程序的验证、生产过程**效果的监控等。”从定义可以看出,生物指示剂是一类含有活的微生物的测试系统,其主要用于**工艺的验证或监控。
生物指示剂是用于**工艺,在介绍其之前,我们需要了解**的原理,以便理解生物指示剂的特性、使用和质量控制。
一、**原理
所谓**,即“用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去,从而使物品残存活微生物的概率下降至预期的无菌保证水平的方法。(2015年版《中国药典》)”**主要有杀灭和除去两种方式,前者是通过物理或者化学的手段杀灭产品中的微生物,后者则是通过一定的分离机制(目前主要是过滤的方式)将微生物从产品中分离。这两种方式的机理不同、动力学不同,其适合的模型也不同。本文所阐述的主要是前者,即杀灭的方式去除微生物。
当前制药工业所用的**方式很多,包括热力学**,如湿热**,如蒸汽**、过热水**;干热**;辐照**,如γ射线**、X射线**、电子束**;气体**,如环氧乙烷**、气态过氧化氢**、甲醛**、臭氧**等。这些**方式的**介质不同,杀灭微生物的机理也不同,相应的工艺开发、工艺控制和工业验证也不尽相同。但是,除了辐照**外,从**模型的研究、**工艺的验证和生物指示剂的选择和使用来看,这些**方式都有共通之处。因此,本文以研究*为深入的湿热**为例,详细介绍**动力学和**验证,从而深入了解生物指示剂在其中的作用。
湿热**主要是通过高温使得微生物的蛋白质、核酸等分子发生变性,从而杀灭微生物。这个过程与很多因素有关,如**温度、**时间、微生物的种类和数量、微生物所处的环境、蒸汽质量等等。为研究**的动力学,我们把微生物的数量(N)对**时间(t)作曲线,关系如下:
这一曲线关系不利于**的研究,如果把微生物的数量用对数值进行处理(lgN),再对时间(t)作曲线,则会得到以下的曲线
这里我们可以看到,两者(微生物数量对数值lgN和**时间t)成直线关系。这一转换大大方便了**动力学的研究,也构成了整个湿热**模型的基础。基于此模型,我们了解以下几个重要的参数:
Ø 微生物的耐热性,D值的概念:
自然界的微生物种类多种多样,不同微生物的耐热性是不一样的,反映在**曲线(lgN~t)上,耐热性弱的微生物lgN随着时间下降较快,而耐热性强的微生物lgN随温度下降的速度慢。这一点*直接的反映便是直线的斜率(k),如果直线的斜率(**值,如下图)越大,微生物lgN下降越快,耐热性越低,反之亦然
虽然斜率k值可以反应这一关系,但是为了便于理解和日常运用,我们在斜率k的基础上进行一个简单的变换,引入D值的概念。令D=−1/k=△t/△lgN,即,D值可以理解为微生物数量下降一定的对数值所需要的时间。当△lgN为1时,所需要的**时间恰好等于D值,故D值定义为使微生物下降一个对数值所需要的**时间。因微生物数量下降一个对数值与杀灭90%的意义相同,故D值又称之为90%杀灭时间。这样的简单转换,使得D值的定义易于理解,在**工艺中也方便应用,这一点在后面的介绍中会得到体现。
D值的影响因素很多,包括(但不限于):
有了D值,便可以对**后的微生物数量进行计算。初始污染菌数为N0表示,**后的污染菌数用NF表示,某一温度下的D值用DT表示,**时间用t表示,则:
(lgN0–lgNF) = t/DT ,也即lgNF =lgN0 –t/DT
假定某一物品初始污染菌数N0 为106,某一温度T下的D值为2.5min,则:
***1分钟后,lgNF= lgN0–t/DT = 6–1/2.5 = 5.6
* **2分钟后,lgNF= lgN0–t/DT = 6–2/2.5 = 5.2
这里可以看到,随着**时间t的无限增加,lgNF变得无穷小,但NF是始终大于0的,也就是说,**的无菌(NF为0)理论上来说是不存在的。在制药行业中,NF为10-6,也就百万分之一便是终端**产品可以接受的无菌保证(概率)水平。因此,在这个案例中,如果要达到百万分之一的无菌保证水平,所需要的**时间为:
-6 = 6–t/2.5, 即**时间t需要30分钟。
Ø 微生物的耐热性(D值)与温度的关系,Z值的概念
引入D的模型只考虑了同一温度下的**曲线,即**过程中温度没有波动时微生物数量lgN与**时间t之间的关系。事实上,产品**时是无法将**温度控制在某一恒定温度的。而D值,即微生物的耐热性,是与温度直接相关的,温度越高,D值越小,温度越低,D值越大。如果要研究产品的**过程,我们就需要找到D值与温度的关系。
这里,我们测定同一微生物在不同**温度下的D值(测试方法将在本专题的**部分介绍),把微生物的D值的对数值lgD(纵坐标)与产品的温度T(横坐标)作曲线,会得到以下直线关系:
这里可以看出,lgD与**温度T是成直线关系的(模型与lgN~t相同)。通过直线可以看出,lgD与T的负相关性与我们研究D值的来源正好相同。同样,为了便于理解和日常运用,我们也不直接用斜率k来反应这样的关系,而是引入Z值的概念;同样,令Z=−1/k=△T/△lgD,当lgD等于1时,所需要提高的温度△T恰好等于Z值。因此,Z值的定义即为D值下降一个对数值所需要提高的温度。
研究表明,大部分的微生物Z值均在10 ℃左右(湿热**),因此,在无特殊说明的情况下,为简化计算,Z值均默认为10 ℃。
Ø 不同温度下**时间的换算,等效**时间FTref的概念
**工艺虽然有温度波动,但是有了Z值的概念,我们便可以将不同温度下的等效**时间通过D值进行换算。将不同温度下得**时间用FTT表示,要换算120 ℃下的**时间,等效于121 ℃下的**时间,可根据lgN~T的关系曲线:
F121 = D121×△lgN
F120 = D120×△lgN
所谓等效**时间,即**效果相同所需要的**时间,因此两者的△lgN相等。两等式相除,得到:
这个公式需要我们考察D值与温度的关系,这恰好是Z值的概念。根据考察Z值时D值与温度的关系,我们得到:
故,120 ℃**1分钟,其相当于在121 ℃下的**时间为0.79分钟。
同理,我们可以计算出**过程中任何温度(T)下的**时间(FT)相当于其在121 ℃下的等效**时间(F121),即:
F121 = FT×10(T-121)/Z
同样,我们也可以将**过程中的任何温度(T)下的**时间(FT)换算为其在任何参考温度Tref下的等效**时间(FTref),即:
FTref = FT×10(T-Tref)/Z
Ø **工艺的**能力,F0值的概念
如果我们把所有的**工艺都统一换算为同一温度下的**时间,则不同**工艺的**能力便有了可比性,也可以针对**能力制定量化的标准,这一参考温度便是121.1℃。如果把**过程中每一时刻的**时间都换算为121.1℃的**时间,再进行累积,得到整个**过程在121.1℃下的**时间,这一时间便是F0值(ISO17665,Z值定义为10℃)。
二、**工艺的**能力要求
前面我们介绍过,产品的无菌保证水平(SAL)为10-6。而**工艺要达到这样的SAL,所需要的**能力取决于**前的微生物负载(**前的微生物数量)和微生物负载的耐热性。制药行业一般都有严格的微生物污染控制措施,**前的微生物负载(N0)一般不会超过1066,故106便认为是微生物负载的*差条件;自然界中很少会发现D121℃大于0.5分钟的微生物,故D121℃值为1分钟,便认为微生物负载耐热性的*差条件。
F0 = D121℃×(lgN0-lgNt)= 1×(6-(-6)) = 12分钟
备注:EMA要求不低于15分钟。
此时,由于微生物负载的数量和耐热性都取*差条件,日常**时,对于二者的监控不是必须的。
F0= D121℃×(lgN0-lgNt) = 1×(2-(-6)) = 8分钟
这也是GMP规定F0值一般不低于8分钟的原因。此时,微生物负载的数量 不是取的*差条件,日常**时需要对其进行监控;而耐热性取*差条件, 故对耐热性的监控不是必须的。
F0= D121℃×(lgN0-lgNt) = 0.4×(2-(-6)) = 3.2分钟
此时,微生物负载的数量和耐热性都不是取*差条件,日常**时需要对两者同时进行监控。
三、**工艺验证中的生物指示剂
根据2010年版GMP的要求,“第六十三条 任何**工艺在投入使用前,必须采用物理检测手段和生物指示剂,验证其对产品或物品的适用性及所有部位达到了**效果。”因此,在验证某一**工艺时,不仅仅要采用物理的检测手段(对于湿热**而言,主要是温度,还包括压力、蒸汽质量等),还需要采用生物指示剂进行检测,以确保**工艺达到预期的**效果。单纯的物理测试,一方面其检测的参数有限,不能反应所有的影响因素对于**工艺的影响。常见的湿热**,主要检测的参数为温度和压力,但是,蒸汽质量(过热值、干燥度、不凝气体)、产品的特性(微生物的耐热性与其所处的环境相关)等对于**效果的均有影响,同时,物理检测基于前面所述的理论模型进行预测的,实际状况与理论模型不一定完全契合。因此,要验证**工艺,还需要用生物指示剂进行考察,以确保物理杀灭效果(用FPHY)和生物杀灭效果(FBIO)具有一致性。这便是生物指示剂的选择基础。
四、生物指示剂的选择-物理杀灭和生物杀灭的关系
选择生物指示剂的选择的主要依据是证明FPHY和FBIO具有一致性,即物理杀灭效果能够实际杀灭相应的生物指示剂。实际操作过程时,我们通常会选择合适的生物指示剂,经过**工艺**后进行培养,如果全部呈阴性,那么我们判定**工艺符合预定标准。
假定某一**工艺,其物理杀灭效果(FPHY)为F0值不低于12分钟,理论来说,为证明一致性,所使用FBIO也应为12分钟,这样才能证明两者是一致的。假定所选择的生物指示剂的D121℃为2分钟,数量为106,则其杀灭所需要的时间理论上为:
FBIO= D121℃×(lgN0-lgN) = 12分钟
看上去,FPHY和FBIO的时间刚好相当,可选择该生物指示剂进行**的验证。然而,在介绍无菌保证水平的时候我们知道,微生物存活是一个概率问题。在这个案例中,当FBIO为12分钟时,**后的污染菌数量NFF为:
lgNF =lgN0–t/DT = 6–12/2 = 0,则 NF=1
也就是说,产品中依然有菌,生物指示剂**后培养时很大概率呈阳性。那么,问题来了,生物指示剂要如何选择,才能证明FPHYHY与FBIO是一致的?根据EP9.0的要求,在进行**工艺验证时,验证时时所选择的**时间(tvl),应将生物指示剂杀灭到10-1到10-3的水平,即
以上述生物指示剂为例,为验证FPHYY和FBIO是一致的,选择的FPHY应将生物指示剂**后的数量NF下降至-1至-3个log值(原来下降至0个log值),即:
即:2×(6+1) ≤tvl≤2×(6+3)
即:14≤tvl≤18 (分钟)
而PDA则建议将生物指示剂杀灭到10-2的水平。(备注:将生物指示剂杀灭到102所需要的时间,即**结束后,生物指示剂全部呈阳性的时间,为生物指示剂的存活时间,survival time;将生物指示剂杀灭到10-4所需要的时间,也即生物指示剂**后全部呈阴性的时间,为生物指示剂的杀灭时间, kill time)。如果验证时,选择的**时间tvl大于kill time,则无法证明FPHY和FBIO具有一致性。这时,我们可以选择减少**时间(如半循环),或降低**温度(这时需要知道生物指示剂在实际**条件下的Z值)来进行**工艺的验证,当然也可以选择合适的生物指示剂,使得该生物指示剂的survival time和kill time满足**参数的要求。
总结:本文介绍了**的原理、**的动力学、**参数和**工艺的选择,在此基础之上,介绍了如何选择合适的生物指示剂,以验证物理杀灭和生物杀灭的一致性。下一部分,我们会根据此理论基础,介绍生物指示剂的种类、选择、使用和质量控制。